Aktuelle Mitteilungen
aus dem Institut für Klinische Chemie
des Universitätsklinikums Großhadern der Ludwig-Maximilians-Universität München

Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Seidel

III / 2000 30. August 2000

LABOR aktuell erscheint ca. 1/4-jährlich als hausinterne Information für die Kliniken und Institute des Klinikums Großhadern sowie externe Einsender des Instituts. Alle Ausgaben sind auch über die Homepage des Instituts im Intranet einsehbar.

Schriftleitung Dr. med. M. Vogeser (Tel. 7095-3246, email: michael.vogeser@med.uni-muenchen.de)
HTML-Version A. Dischner (Tel. 7095-3202, Email: dischner@med.uni-muenchen.de)

 

Inhalt

TRAK S. 1
Pharmakogenetik S. 1
SLA-Antikörper S. 2
Ringversuchszertifikate S. 3
AFP im Fruchtwasser S. 4

TSH-Rezeptor-Antikörper (TRAK):
neue Methode und neuer Referenzbereich

Im Interesse einer höheren Sensitivität bei gleichzeitig hoher Spezifität für die Diagnose Morbus Basedow wurde die Methode zur Bestimmung von TSH-Rezeptor-Antikörpern auf einen Lumineszenz-Immunoassay auf der Basis eines humanen TSH-Rezeptors umgestellt. Dadurch ändern sich Wertlage und Referenzbereich erheblich. Bekannte, TRAK-positive Patienten werden für die Verlaufskontrolle übergangsweise mit beiden Methoden untersucht.

Verfahren: TRAK,

direkt ankreuzbar auf Beleg 7

Referenzbereich (vorläufig):

negativ < 1 IU/l,
grenzwertig 1-2 IU/l

OA Dr.med. M. Wick (Tel. -3205, Funk 124-455)

Beeinflussung des Arzneistoff-Metabolismus durch eine Variante des P-Glykoproteins (C3435T)

Ausgeprägte interindividuelle und interethnische Unterschiede in der Verstoffwechslung von Arzneimitteln beruhen zum Teil auf genetisch determinierten Polymorphismen derjenigen Gene, deren Proteinprodukte für den Metabolismus dieser Stoffe verantwortlich sind (Feuring et al. 2000, Internist 41: 332-337). Eine dieser Sequenzvariationen ist ein C/T-Polymorphismus an cDNA-Position 3435 in Exon 26 des "multidrug-resistance" (MDR)-1-Gens, der mit der MDR-1-Expression korreliert (Hoffmeyer et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3473-3478). Das Produkt des MDR-1-Gens ist das soge-nannte P-Glykoprotein (P-gp oder P170), das zur Familie der "ATP-binding cassette" (ABC)-Transporter gehört und Arzneistoffe durch einen energie-abhängigen, gerichteten Transport über die Zell-membran aus der Zelle heraustransportiert. Damit schützt sich die Zelle vor toxischen Substanzen oder deren Metaboliten. So kontrolliert das im Enterozyten vorkommende P-Glykoprotein den Rücktransport der Pharmaka in das Darmlumen, während es in den Endothelzellen die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke steuert. Dementsprechend kann die Expression des MDR-1-Gens und damit die Menge des synthetisierten P-Glykoproteins direkt die Arzneimittelwirkung beeinflussen: hohe Spiegel führen zu verminderten Wirkstoff-konzentrationen, während niedrige Spiegel zur Akkumulation des Pharmakons in der Zelle und zu unerwünschten Nebenwirkungen führen können. Zu den Substanzen, die das P-Glykoprotein transportiert, gehören Anthracycline, Celiprolol, Clarithromycin, Cyclosporin A, Dexamethason, Digoxin, Domperidon, Itraconazol, Loperamid, Morphin, Ondansetron, Paclitaxel, Phenytoin, Rifampicin, Saquinavir, Talinolol, Verapamil und die Vincaalkaloide (Paneitz et al. 2000, Internist 41: 338-343). Es konnte gezeigt werden, daß T/T-Homozygote eine signifikant niedrigere Expression des MDR-1-Gens im Duodenum und dementsprechend eine höhere Resorptionsrate und damit die höchsten Digoxin-Plasmaspiegel nach oraler Applikation aufweisen. Homozygotie für das normale C-Allel war dagegen mit der höchsten P-Glykoprotein-Expression und im Mittel mit einer um 38 % niedrigeren maximalen Digoxin-Plasma-konzentration assoziiert (Hoffmeyer et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3473-3478).

Durchführung: Aus einer EDTA-Blutprobe des Patienten wird die genomische DNA der weißen Blutzellen isoliert. Anschließend wird das Exon 26 des MDR-1-Gens mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und der Polymorphismus durch einen Restriktionsverdau mit dem Enzym Dpn II untersucht.

Verfahrensnummer: 0067

Antrag Nr. 1 "Serumchemie", frei markierbar


Material: 2 ml EDTA-Blut

PD Dr. med. P. Lohse (Tel. -3233)



Antikörper gegen lösliches Leberantigen (SLA-Antikörper) in der Diagnostik der Autoimmunen Hepatitis

Die Autoimmune Hepatitis (AIH) wird zusammen mit der Primär biliären Zirrhose (PBC) und der Primär sklerosierenden Cholangitis (PSC) zu der Gruppe der primär autoimmunen Lebererkrankungen gerechnet. Verläßlichen Daten zufolge stellt sie einen Anteil von ca. 15% am Kollektiv der chronisch aktiven Hepatitiden (1). Da die Immunsuppression bei der AIH Therapie der Wahl ist, durch sie wird - selbst im fortgeschrittenen Krankheitsstadium - eine langjährige nicht selten sogar lebenslange Remission erreicht, hat die Erkennung der AIH entscheidende therapeutische Konsequenzen.
Für die Diagnose "Autoimmune Hepatitis" gelten nach Ausschluß von Alkoholabusus, Virushepatitis, Medikamentenwirkung, Hämochromatose und Morbus Wilson histologische, laborchemische und serologische Kriterien (2): In der Leberhistologie findet sich im Gegensatz zu PBC und PSC eine periportal betonte Entzündungsreaktion ohne Fibrose ("Mottenfraßnekrosen"); klinisch-chemisch imponiert die AIH vor allem durch eine sensitive aber unspezifische Erhöhung von Bilirubin, der Transaminasen und des Immunglobulin G; die HLA-Typisierung mit Nachweis des charakteristischen Haplotyps HLA-B8, DR3 oder DR4 (3) deutet auf eine immungenetische Prädisposion der Erkrankung hin. Serologisch wird die AIH in ca. 70% der Fälle durch den Nachweis von Autoantikörpern gegen Kerne (ANA), Antikörper gegen glatte Muskulatur vom Aktin-Typ (SMA) und Antikörpern gegen den P450-Enzymkomplex (LKM-1) charakterisiert. Ein weiterer Antikörper, gegen das lösliche Leberantigen (SLA), wird bei etwa 30 % der Patienten mit Autoimmunhepatitis gefunden, wobei ein erheblicher Teil dieser Seren Anti-SLA als einzigen Autoantikörper aufweist (4). Die bisher gebräuchliche Subklassifizierung der Autoimmunen Hepatitis in drei Typen (Typ I: ANA/Anti-SMA-positiv, Typ II: LKM-1-positiv, Typ III.: SLA-positiv) ist aufgrund ihrer bisher nicht nachgewiesenen klinischen und therapeutischen Relevanz zumindest umstritten und sollte daher durch Begriffe wie ANA/Anti-SMA-positive AIH, LKM-1-positive AIH oder SLA-positive AIH ersetzt werden (5).

Während der Nachweis von Antikörpern gegen ANA, LKM-1 und SMA schon seit längerem Eingang in die Routine-Diagnostik gefunden hat, war die zuverlässige Bestimmung von Antikörpern gegen SLA aufgrund ihrer fehlenden Nachweisbarkeit in der indirekten Immunfluoreszenz und ihres bisher unbekannten Zielantigens wenigen Speziallaboratorien vorbehalten. Nachdem erst kürzlich die Identifizierung des Zielantigens der SLA-Antikörper auf molekularer Ebene gelang (6), konnte jetzt gezeigt werden, daß es sich um ein zytosolisches Protein der Hepatozyten mit vermutlich enzymatischer Aktivität handelt, das an der Regulation der Proteinbiosynthese beteiligt ist (UGA-Suppressor-tRNA-assoziiertes Protein). Es existiert in zwei Splicevarianten (50 kDA und 48 kDa), die kodierende Sequenz ist auf dem Chromosom Nr. 4 des menschlichen Genoms lokalisiert (4). Die antigene Determinante des aus 422 Aminosäuren bestehenden SLA-Antigens befindet sich an Position 371 - 409 am Carboxy-terminalen Ende des Proteins. Messungen, die mit dem klonierten und rekombinant hergestellten Antigen durchgeführt wurden, erbrachten im Vergleich zur bisher etablierten und vermutlich weniger spezifischen Methode - unter Berücksichtigung der Seren von einigen Patienten mit einem "Overlap-Syndrom" zwischen PBC und AIH - eine Spezifität von 100% bei einer Sensitivität von 90% für das gesamte Kollektiv. Wurden nur Seren mit höheren Anti-SLA Titern berücksichtigt, betrug die Sensitivität ebenfalls 100% (4). Im Gegensatz zu ANA, Anti-LKM oder SMA, die bei 14 - 19 % der Patienten mit viralen Hepatitiden oder anderen Erkrankungen mit autoimmuner Genese nachgewiesen werden (7), wäre Anti-SLA nach der gegenwärtigen Datenlage der einzige hochspezifische Immunmarker zum Nachweis einer AIH. Andere seltenere Autoantikörper mit Assoziation zur AIH werden, wie ASGPR , LMA, LCA-1 zum Teil auch bei viralen Hepatitiden oder anderen Erkrankungen der Leber gefunden (8, 10, 11). Antikörper gegen Leber und Pankreasantigen (Anti-LP) sind mit Anti-SLA identisch (6).
Da SLA, wenn auch in wesentlich geringeren Konzentrationen, in verschiedenen anderen Geweben einschließlich der Lunge, der Niere und des Pankreas nachweisbar ist (4), sollte die pathogenetische Bedeutung dieser Autoantikörper, ebenso wie ihre absolute Spezifität für Pathogenese bzw. Diagnose der AIH derzeit noch zurückhaltend beurteilt werden. Der seltene Nachweis von SLA zusammen mit AMA in einigen Fällen eines "Overlap Syndroms" zwischen PBC und AIH (4, 9) kann als Hinweis auf eine eingeschränkte Spezifiät von SLA in der Differentialdiagnose autoimmuner Lebererkrankungen gelten. Die beschriebenen Fälle werden als hepatische Verlaufsform der PBC aufgefaßt (4, 9), wobei als therapeutische Konsequenz des zusätzlichen Nachweises von Anti-SLA der Einsatz von Immunsuppressiva empfohlen wird. Nach eingehender Austestung von Sensitivität und Spezifität bietet das Institut für Klinische Chemie nunmehr die Bestimmung auf Basis eines ELISA an, der mit dem rekombinanten SLA-Antigen arbeitet. Nachgewiesen werden SLA-Antikörper der Immunglobulinklasse G.
Bewertung: In Ermangelung eines Internationalen Referenzserums wird die Kalibrierung des Assays in relativen Einheiten vorgenommen. Da SLA-Antikörper in allen Fällen auch unter Therapie nachweisbar blieben und keine eindeutige Korrelation des Antikörpertiters mit dem Verlauf feststellbar war (4), ist für die Krankenversorgung die qualitative Testauswertung ausreichend. Die Befundmitteilung erfolgt in Form einer Ratio. Proben mit einer Ratio <1 gelten als negativ, Proben mit einer Ratio von >1 als positiv.

Referenzbereich (vorläufig):

Ratio <1: Anti-SLA-negativ
Ratio >1: Anti-SLA-positiv

Methode:
Enzymimmunoassay

Untersuchungsmaterial:
Serum

Untersuchungsantrag:
Beleg 7

Verfahrensnummer: 2783

Indikation:
Unklare Transaminasen- und IgG-Erhöhung, Verdacht auf Autoimmune Hepatitis, Differentialdiagnose der hepatischen versus biliären Form der PBC

OA Dr. med. Wick (Tel. -3205, Funk 124-455)
Dr. med. P. Eichhorn (Tel. -3239, Funk 124-855)


Literatur:
1) Czaja AL. Semin Liver Dis 1987; 4: 1 - 12
2) Alvarez F et al. J Hepatol 1999; 31: 929 - 38
3) Krawitt EL. Autoimmune hepatitis. N Engl J Med 1996; 334: 897 - 903
4) Wies I. et al.. Lancet 2000; 355: 1510 - 1515
5) Kanzler S et al. J Hepatol 1999; 31: 635 - 40
6) Wies I et al. Z Gastroenterol 1999; 37: 107A
7) Lohse AW et al. Z Gastroenterol 1995; 33: 527
8) Treichel U et al. Gastroenterology1994; 107: 799
9) Lohse AW et al. J Hepatol 1999; 29: 1078 - 84
10) Frazer ICH et al. Clin Exp Imm 1983: 54: 213
11) Lenzi M et al. Gut 1995; 36: 749


Aktuelle Ringversuchszertifikate des Instituts für Klinische Chemie

Neben der kontinuierlichen internen Qualitätskontrolle (Mitführung von Richtigkeits- und Präzisionskontrollproben in jeder analytischen Serie mit entsprechender Dokumentation) stellt die regelmäßige Teilnahme an externen Qualitätskontrollmaßnahmen (Ringversuchen) ein zentrales Prinzip zur Qualitätssicherung im medizinischen Labor dar. Grundlage der Qualitätssicherung im medizinischen Labor und somit auch der Ringversuche sind die entsprechenden Richtlinien der Bundesärztekammer, die auf der Eichordnung und dem Eichgesetz gründen. Die Einhaltung dieser Richtlinien wird von den Landeseichämtern überwacht. Mit der Durchführung und Auswertung der Ringversuche beauftragt die Bundesärztekammer geeignete Institutionen. Bei den Ringversuchen werden von den teilnehmenden Laboratorien jeweils zwei von der ringversuchsleitenden Institution zur Verfügung gestellte, dem Labor hinsichtlich ihrer Zusammensetzung unbekannte Ringversuchsproben vermessen. Der Ringversuch für einen bestimmten Parameter ist bestanden, wenn in beiden Proben der in einem Referenz- oder Sollwertlabor ermittelte Zielwert für die Konzentration des entsprechenden Analyten richtig gemessen wird, wenn also eine in den Richtlinien definierte maximal zulässige Abweichung vom Zielwert nicht überschritten wird. Ist diese Vorgabe erfüllt, so wird von der ringversuchsleitenden Institution dem teilnehmenden Labor ein Zertifikat ausgestellt, welches jeweils ein Jahr Gültigkeit besitzt. Da universelle Ringversuchsproben, die für die Gesamtheit der in medizinischen Laboratorien bestimmten Kenngrößen geeignet sind, nicht existieren, werden Ringversuche prinzipiell für bestimmte Teilbereiche des labormedizinischen Spektrums durchgeführt, z. B. separat für Parameter der Serumchemie, Hormonparameter, Tumormarker, etc. Die Zertifikate listen jeweils alle Kenngrößen auf, die in dem Ringversuch geprüft wurden und die das teilnehmende Labor korrekt bestimmt hat. Ein Zertifikat wird dem Labor nicht ausgestellt, wenn entweder eine Fehlbestimmung in mindestens einer der beiden Ringversuchsproben vorliegt, oder gelegentlich, wenn sich bei der Durchführung des Ringversuchs technische Probleme herausstellen (z.B. Degradation eines Analyten im versandten Ringversuchsmaterial).
Nicht für alle von medizinischen Laboratorien bestimmten Kenngrößen werden von den entsprechenden Institutionen Ringversuche mit Erstellung eines Zertifikates angeboten. Kenngrößen, für die keine ausreichend zuverlässigen Methoden zur Bestimmung des Soll- oder Referenzwertes zur Verfügung stehen, sind in Ringversuchen nicht zertifikatfähig. Soweit in diesen Fällen Ringversuche überhaupt angeboten werden, erhalten die Teilnehmer lediglich Teilnahmebestätigungen. Für manche in medizinischen Laboratorien bestimmten Kenngrößen stehen Ringversuche grundsätzlich nicht zur Verfügung, z. B. weil sich aufgrund von Instabilitäten des Analyten geeignete Ringversuchsproben nicht herstellen lassen.

Im Rahmen klinischer Studien, in denen Laboruntersuchungen als Zielkriterien oder Sicherheitsparameter einbezogen sind, wird die Vorlage von Ringversuchszertifikaten des beteiligten Labors verlangt. Auf der
Intranet-Homepage des Instituts für Klinische Chemie wird seit kurzem die Möglichkeit geboten, die jeweils aktuell gültigen Zertifikate für die einzelnen Teilbereiche des Instituts für Klinische Chemie einzusehen und bei Bedarf, z. B. zur Weiterleitung an den Studiensponsor, auszudrucken. Bei weiteren Fragen zur Durchführung der Dokumentation der externen Qualitätskontrolle des Instituts oder falls Zertifikate für weiter zurückliegende Zeiträume benötigt werden, wenden Sie sich bitte an das Oberarztsekretariat des Instituts (Durchwahl 3219).
Ltd. OA Dr.med. P. Cremer (Tel. -3219)

Die Alpha - Fetoprotein (AFP)-Bestimmung in der Amnionflüssigkeit im Rahmen der pränatalen Diagnostik

Neben der unbestrittenen Bedeutung des AFP als tumorassoziiertes Antigen kommt der Alpha-Fetoproteinbestimmung im Fruchtwasser ein hoher Stellenwert in der Pränataldiagnostik zu.
Beim AFP handelt es sich um ein Glykoprotein, das dem Albumin stark ähnelt und einen Kohlenhydratanteil von ca. 9% und ein Molekulargewicht von etwa 70.000 Dalton aufweist. Es besteht aus 590 Aminosäuren mit 15 regelmäßigen Disulfidbrücken und zeigt eine Faltblattstruktur von drei sich wiederholenden Domänen. Als Bildungsorte gelten der Dottersack, die fetale Leber sowie der fetale Gastrointestinaltrakt. Physiologischerweise wird das AFP über die fetalen Nieren in die Amnionflüssigkeit ausgeschieden; diaplazentar tritt es in das maternale Blut über.
Bewertung: Die AFP-Konzentration im Fruchtwasser erreicht die höchsten Werte etwa in der 13. Schwangerschaftswoche. Daraufhin erfolgt eine schnelle Abnahme bis zur 22. Schwangerschaftswoche sowie in der Folge eine langsamere Abnahme bis zur Geburt. Weist der Fetus einen offenen Neuralrohrdefekt auf, so leckt das AFP direkt in die Amnionflüssigkeit und verursacht dort pathologisch hohe Werte. Ist die AFP-Konzentration im Fruchtwasser größer als das 3-fache des Medians, bezogen auf die entsprechende Schwangerschaftswoche, so beträgt die Wahrscheinlichkeit, daß eine Einlingsschwangerschaft mit Neuralrohrdefekt vorliegt 24 : 1 (Wald N.J. et al. 1992, BMJ 305: 391-394). Die Diagnostik erfolgt in der Regel zwischen der 16. und der 20. Schwangerschaftswoche.




Abb.: Alpha-Fetoprotein in der Amnionflüssigkeit in Abhängigkeit vom Gestationsalter

1 Die vorliegende AFP-Konzentration liegt - bezogen auf die entsprechende Schwangerschaftswoche - im Referenzbereich.
2 Die vorliegende AFP-Konzentration liegt oberhalb des 2,5-fachen Medians, jedoch unterhalb des 3-fachen Medians (bezogen auf die entsprechende Schwangerschaftswoche) und somit im niedrig pathologischen Bereich (kritischer Bereich).
3 Die vorliegende AFP-Konzentration liegt - bezogen auf die entsprechende Schwangerschaftswoche - im pathologischen Bereich. Es besteht der V.a. Neuralrohrdefekt des Feten (DD: kongenitale Nephrose, Omphalocele, Ösophagus/Duodenal-Atresie, teratoider Tumor des Feten, fetal stress syndrome, fetaler intrauteriner Fruchttod).

Bei kritischer oder pathologischer AFP-Konzentration ist eine gezielte Ultraschalldiagnostik und gegebenenfalls die zusätzliche Bestimmung der Acetylcholinesterase (ACHE nicht PCHE!!!) empfehlenswert. Cave: Unspezifische Erhöhungen entstehen durch Kontamination des Fruchtwassers mit fetalem Blut, in dem eine etwa 150-fache AFP-Konzentration vorliegt (Ausschluß z.B. durch Kleihauer-Test)!
Bei Schwangerschaften mit Fehlbildungen der ableitenden Harnwege (Nierenagenesie, Harnwegsatresie) , findet man gehäuft auffallend niedrige AFP-Spiegel (Thomas L., Labor und Diagnose, 1998, S. 1371, 5. Auflage). Somit ist auch bei niedrigen AFP-Werten eine klinische und ggf. genetische Abklärung dringend erforderlich.
Methode: Für die AFP-Bestimmung stehen unterschiedliche kommerzielle Immunoassays zur Verfügung (Radio-, Enzym-, Fluoreszenz- sowie Chemilumineszenz-Immunoassays). Verwendet werden dabei sowohl mono- wie auch polyklonale Antikörper. Die verwendete Methode entscheidet darüber, welche Konzentration an AFP gemessen wird. Selbst wenn es sich um dasselbe methodische Prinzip unter Verwendung identischer Antikörper handelt, können unterschiedliche Testkits in der gleichen Probe verschiedene Meßwerte erbringen. Somit ist es unerläßlich, daß an großen Kollektiven methodenspezifische Medianwerte erstellt werden. Jeder Meßwert sollte unbedingt mit dem Namen des Herstellers und der verwendeten Methode gekennzeichnet sein.

Verfahren: Alpha-Fetoprotein im Fruchtwasser

Verfahrensnummer:
2793 , Beleg 7

Untersuchungsmaterial: Amnionflüssigkeit

Unbedingt zu beachten: Angabe des genauen Gestationsalters !

Dr.Dr.med. W. Reiter (Tel. -3116, Funk 124-452)
Dr.med. P. Stieber (Tel. -3116, Funk 124-451)